Sắc ký loại trừ theo kích thước là gì? Nghiên cứu liên quan

Giới thiệu về sắc ký loại trừ theo kích thước

Sắc ký loại trừ theo kích thước (Size Exclusion Chromatography, SEC) là một kỹ thuật tách chất dựa trên kích thước và hình dạng của các phân tử trong dung dịch. Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu sinh học phân tử, hóa học phân tích, công nghệ polymer và dược phẩm. SEC được phát triển vào thập niên 1950 và nhanh chóng trở thành một công cụ quan trọng trong các phòng thí nghiệm nhờ khả năng tách nhanh, không phá hủy cấu trúc và không yêu cầu tương tác hóa học mạnh giữa mẫu và pha tĩnh.

Kỹ thuật này hoạt động theo nguyên tắc rằng các phân tử lớn sẽ đi qua cột nhanh hơn so với các phân tử nhỏ vì chúng không thể xâm nhập sâu vào hệ thống lỗ xốp của vật liệu nhồi cột. Ngược lại, các phân tử nhỏ hơn có thể đi vào nhiều lỗ xốp hơn, dẫn đến quãng đường di chuyển dài hơn và thời gian rửa giải lâu hơn. Vì vậy, thời gian lưu của mỗi thành phần phụ thuộc trực tiếp vào kích thước hydrodynamic của nó, chứ không phải vào khối lượng phân tử một cách tuyệt đối.

SEC thường được gọi bằng các tên khác nhau tùy theo lĩnh vực ứng dụng. Trong hóa polymer, kỹ thuật này được gọi là Gel Permeation Chromatography (GPC), trong khi trong sinh học phân tử, thuật ngữ phổ biến hơn là Gel Filtration Chromatography. Dù tên gọi khác nhau, nguyên lý hoạt động và cấu hình thiết bị về cơ bản là tương tự nhau. SEC đặc biệt hữu ích cho việc xác định phân bố kích thước phân tử và loại bỏ các tạp chất có kích thước khác biệt đáng kể với chất chính.

• Ứng dụng trong nghiên cứu protein, enzyme, axit nucleic.
• Kiểm tra tính đồng nhất của polymer tổng hợp.
• Loại bỏ muối và các phân tử nhỏ khỏi dung dịch mẫu.

Nguyên lý hoạt động

Nguyên lý của SEC dựa trên sự phân tách các phân tử khi chúng di chuyển qua một cột chứa các hạt gel xốp. Các hạt này được chế tạo sao cho có một phân bố lỗ xốp nhất định, chỉ cho phép các phân tử có kích thước nhỏ hơn một ngưỡng nào đó xâm nhập. Phân tử càng nhỏ, càng có khả năng đi vào nhiều lỗ xốp hơn, dẫn đến thời gian di chuyển qua cột dài hơn.

Quá trình tách diễn ra hoàn toàn do yếu tố vật lý, cụ thể là sự khác biệt về thể tích chiếm chỗ của các phân tử trong dung dịch. Không có sự tương tác hóa học hoặc lực hút – đẩy đặc hiệu nào giữa mẫu và pha tĩnh, điều này giúp tránh làm biến tính các phân tử nhạy cảm như protein. SEC do đó được xếp vào nhóm các phương pháp tách “không tương tác” (non-interactive).

Thời gian lưu (retention time) và thể tích rửa giải (elution volume) của các phân tử được xác định bởi thể tích chết ($V_0$) và thể tích tổng của cột ($V_t$). Một số khái niệm cơ bản:

• Thể tích chết ($V_0$): phần thể tích dung môi nằm bên ngoài các lỗ xốp.
• Thể tích bên trong lỗ ($V_i$): tổng thể tích dung môi có thể chứa trong các lỗ xốp.
• Thể tích tổng ($V_t$): $V_t = V_0 + V_i$.

Mối quan hệ giữa thể tích rửa giải và hệ số phân bố được mô tả bằng công thức:

$K_{av} = \frac{V_e - V_0}{V_t - V_0}$

Trong đó $K_{av}$ nằm trong khoảng 0 đến 1. Giá trị này phản ánh mức độ một phân tử có thể xâm nhập vào lỗ xốp: giá trị gần 0 nghĩa là phân tử quá lớn, không vào được lỗ; giá trị gần 1 nghĩa là phân tử rất nhỏ, vào được hầu hết các lỗ.

Cấu tạo cột SEC

Một cột SEC gồm các thành phần chính sau:

• Pha tĩnh: hạt gel xốp làm từ polymer tự nhiên (agarose, dextran) hoặc tổng hợp (polyacrylamide, polystyrene-divinylbenzene).
• Pha động: dung dịch đệm duy trì pH và độ ion phù hợp, tránh gây biến tính mẫu.
• Hệ thống bơm: cung cấp dòng chảy ổn định, thường ở tốc độ thấp để tránh làm hỏng cấu trúc cột.
• Detector: phát hiện các phân tử khi chúng rời cột, ví dụ UV-Vis, khúc xạ kế, hay tán xạ ánh sáng.

Bảng dưới đây minh họa một số vật liệu pha tĩnh phổ biến và phạm vi kích thước tách của chúng:

Vật liệu	Nguồn gốc	Phạm vi tách (Da)
Sephadex G-100	Dextran	4,000 – 150,000
Superdex 200	Agarose & Dextran	10,000 – 600,000
Bio-Gel P-6	Polyacrylamide	1,000 – 6,000

Việc chọn vật liệu pha tĩnh phù hợp đóng vai trò quyết định trong độ phân giải và hiệu quả tách. Nếu phạm vi kích thước phân tử của mẫu nằm ngoài vùng tách của vật liệu, kết quả thu được sẽ kém chính xác hoặc không thể phân tách.

Thông số vận hành quan trọng

Để tối ưu hóa hiệu suất SEC, cần kiểm soát một số thông số chính:

• Kích thước và phân bố lỗ xốp: quyết định phạm vi phân tử có thể tách được.
• Tốc độ dòng ($Q$): tốc độ quá cao sẽ làm giảm thời gian tương tác và độ phân giải, tốc độ quá thấp kéo dài thời gian phân tích.
• Chiều dài và đường kính cột: cột dài hơn tăng độ phân giải nhưng cũng làm tăng thời gian phân tích.
• Nhiệt độ: ảnh hưởng đến độ nhớt dung môi và khuếch tán phân tử.

Thể tích chết ($V_0$) và thể tích tổng ($V_t$) cần được xác định chính xác thông qua các phân tử chuẩn có kích thước biết trước. Các mẫu chuẩn thường là protein hoặc polymer tiêu chuẩn như dextran hoặc polystyrene.

Việc hiệu chuẩn cột thường được thực hiện bằng cách chạy một loạt chất chuẩn có kích thước khác nhau và vẽ đồ thị $K_{av}$ theo log(khối lượng phân tử). Đường thẳng thu được sẽ được dùng để ước tính kích thước hoặc khối lượng phân tử của các mẫu chưa biết.

Phương trình đặc trưng

Trong sắc ký loại trừ theo kích thước (SEC), một trong những mối quan hệ toán học quan trọng nhất là phương trình mô tả hệ số phân bố ($K_{av}$) dựa trên thể tích rửa giải của chất phân tích. Phương trình này giúp kết nối dữ liệu thực nghiệm thu được từ quá trình phân tách với các đặc tính vật lý của phân tử, cụ thể là kích thước hydrodynamic hoặc khối lượng phân tử.

Phương trình cơ bản được sử dụng là:

$K_{av} = \frac{V_e - V_0}{V_t - V_0}$

Trong đó:

• $V_e$: Thể tích rửa giải của chất phân tích.
• $V_0$: Thể tích chết của cột (thể tích pha động ngoài lỗ xốp).
• $V_t$: Thể tích tổng của cột (bao gồm cả trong và ngoài lỗ xốp).

Khi $K_{av} \approx 0$, điều đó nghĩa là phân tử có kích thước rất lớn, không thể vào lỗ xốp. Ngược lại, khi $K_{av} \approx 1$, phân tử có kích thước rất nhỏ và có thể xâm nhập hoàn toàn vào các lỗ. Khoảng giá trị trung gian phản ánh mức độ tương đối mà phân tử có thể xâm nhập vào cấu trúc xốp.

Việc vẽ đồ thị $K_{av}$ so với log(khối lượng phân tử) của các chất chuẩn tạo ra đường hiệu chuẩn tuyến tính trong khoảng tách hữu hiệu của cột. Đường này được dùng để ước lượng kích thước hoặc khối lượng phân tử của các mẫu chưa biết một cách định lượng.

Ưu điểm của SEC

SEC được ưa chuộng trong nhiều ứng dụng phân tích và tinh sạch vì nó mang lại nhiều lợi thế so với các phương pháp tách khác. Một số ưu điểm nổi bật:

• Không phụ thuộc vào tương tác hóa học: không xảy ra sự hấp phụ mạnh giữa phân tử và bề mặt hạt gel, hạn chế biến đổi cấu trúc phân tử.
• Bảo toàn cấu trúc phân tử: phù hợp cho các hợp chất nhạy cảm như protein, enzyme, axit nucleic.
• Khả năng phân tích định lượng: khi được hiệu chuẩn, SEC cho phép xác định khối lượng phân tử trung bình và phân bố kích thước.
• Kết hợp dễ dàng với các detector tiên tiến: như Multi-Angle Light Scattering (MALS) hoặc khúc xạ kế để tăng độ chính xác phân tích.

Trong sản xuất dược phẩm, SEC đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát chất lượng, đặc biệt là để phát hiện và định lượng các dạng kết tập (aggregates) của protein đơn dòng, vốn có thể ảnh hưởng đến hiệu lực và độ an toàn của thuốc.

Hạn chế của SEC

Mặc dù SEC có nhiều ưu điểm, nó cũng tồn tại các hạn chế cần lưu ý khi thiết kế thí nghiệm:

• Độ phân giải hạn chế: khó tách các phân tử có kích thước gần nhau.
• Yêu cầu mẫu sạch: hạt rắn hoặc tạp chất không tan có thể làm tắc lỗ xốp hoặc giảm tuổi thọ cột.
• Thời gian phân tích lâu: nếu cần độ phân giải cao, tốc độ dòng phải thấp.
• Không hiệu quả với phân tử tích điện cao: sự đẩy tĩnh điện trong pha động ion thấp có thể làm sai lệch kết quả.

Bảng so sánh dưới đây minh họa sự khác biệt cơ bản giữa SEC và các phương pháp sắc ký khác:

Tiêu chí	SEC	Sắc ký trao đổi ion	Sắc ký ái lực
Nguyên lý	Phân tách theo kích thước	Phân tách theo điện tích	Phân tách theo liên kết đặc hiệu
Yếu tố ảnh hưởng chính	Kích thước hydrodynamic	pH, nồng độ muối	Ái lực giữa ligand và target
Độ chọn lọc	Thấp - trung bình	Cao	Rất cao

Ứng dụng trong nghiên cứu và công nghiệp

SEC được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học và công nghệ. Trong sinh học phân tử, SEC giúp phân lập protein đơn lẻ hoặc phức hợp protein, loại bỏ muối, đệm và các phân tử nhỏ khỏi dung dịch. Đặc biệt, đây là bước tinh sạch phổ biến trong các quy trình tinh chế protein tái tổ hợp.

Trong công nghiệp polymer, SEC (dưới tên GPC) là công cụ tiêu chuẩn để xác định phân bố khối lượng phân tử của polymer tổng hợp. Phân bố này ảnh hưởng trực tiếp đến tính chất cơ học, độ bền nhiệt và độ nhớt của sản phẩm.

Một số ứng dụng tiêu biểu:

1. Phân tích sự kết tập của kháng thể đơn dòng trong dược phẩm sinh học.
2. Xác định khối lượng phân tử trung bình số ($M_n$) và trung bình trọng lượng ($M_w$) của polymer.
3. Tách axit nucleic theo kích thước để phục vụ nghiên cứu gen và RNA.
4. Loại bỏ các phân tử không mong muốn trong dung dịch enzyme công nghiệp.

Xu hướng phát triển

Các nghiên cứu hiện nay tập trung vào việc nâng cao độ phân giải và tốc độ phân tích của SEC. Việc sử dụng hạt nano xốp với phân bố lỗ chính xác giúp mở rộng phạm vi tách và giảm thời gian phân tích. Ngoài ra, sự kết hợp SEC với các công nghệ phân tích khác như khối phổ (SEC-MS) đang trở nên phổ biến, cho phép thu thập thông tin cấu trúc và khối lượng phân tử đồng thời.

Trong công nghiệp dược, các hệ thống SEC trực tuyến kết hợp detector MALS và RI (khúc xạ kế) được triển khai để giám sát liên tục quy trình sản xuất, đảm bảo chất lượng sản phẩm sinh học ở mức độ cao nhất.

Tài liệu tham khảo

1. Janson, J.C. (2012). Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, and Applications. Springer.
2. Wang, Y. et al. (2023). Advances in size exclusion chromatography for polymer analysis. ACS Omega.
3. Wyatt, P.J. (2021). Light scattering and the absolute characterization of macromolecules. Analytical Chemistry.
4. Smith, R. et al. (2022). Nanoporous stationary phases in modern size exclusion chromatography. Analyst.